การทดสอบด้วยวิธี Agar diffusion

เมื่อนักจุลชีววิทยาหรือคุณหม ออยากทราบว่าการรักษาโรคจากการติดเชื้อจุลินทรีย์ต่าง ๆ ต้องเลือกใช้ยาหรือสารออกฤทธิ์อะไร มีวิธีการตรวจสอบง่าย ๆ คือ การทดสอบด้วยวิธี Agar diffusion (เช่น Paper disc diffusion (Agar disc diffusion), Agar well diffusion, Cylinder cup diffusion และ Agar plug diffusion) หนึ่งในวิธี Agar diffusion คือ Agar well diffusion ซึ่งเป็นวิธีการประเมินฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์ต่าง ๆ เช่น เชื้อแบคทีเรีย เชื้อยีสต์ หรือเชื้อรา ของยาหรือสารต่าง ๆ โดยการเจาะหลุมบนอาหารเลี้ยงเชื้อ (Agar) ที่มีจุลินทรีย์อยู่ แล้วเติมสารที่ต้องการทดสอบลงไปในหลุม สารต่าง ๆ นั้นจะแพร่ออกไปในอาหารเลี้ยงเชื้อ ทำให้เกิดบริเวณที่จุลินทรีย์ไม่เจริญรอบ ๆ หลุม (Inhibition zone) ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ถึงฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์นั้น ๆ ของสารดังกล่าว ข้อดีของวิธี Agar well diffusion คือ เป็นวิธีที่ง่าย สะดวก และประหยัด ไม่ต้องใช้ Paper disc ที่มีราคาแพง สามารถทดสอบฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์ของสารหลาย ๆ ชนิดได้ในการทดลองเดียวกัน สามารถใช้ประเมินฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์เบื้องต้นได้ ข้อจำกัด คือ ไม่สามารถบอกค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้งเชื้อได้ (Minimum inhibitory concentration; MIC) และค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่ฆ่าเชื้อได้ (Minimum microcidal concentration; MMC หรือ Minimum bactericidal concentration; MBC ใช้สำหรับการทดสอบกับแบคทีเรีย) วิธี Agar well diffusion อาจมีผลกระทบจากปัจจัยอื่น ๆ เช่น การแพร่กระจายของสารในอาหารเลี้ยงเชื้อ วิธี Agar well diffusion สามารถประยุกต์ใช้ในการคัดกรองฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ของสารสกัดจากพืช สมุนไพร จุลินทรีย์ สารสังเคราะห์ต่าง ๆ หรือศึกษาฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรียของยาปฏิชีวนะและยาต้านจุลินทรีย์อื่น ๆ การตรวจสอบคุณภาพของยาปฏิชีวนะและผลิตภัณฑ์อื่น ๆ ที่มีฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ แต่ควรเลือกอาหารเลี้ยงเชื้อและสภาวะการบ่มที่เหมาะสมกับชนิดของเชื้อจุลินทรีย์ที่ใช้ทดสอบ ควรมีการควบคุมคุณภาพของจุลินทรีย์ที่ใช้ทดสอบและสารที่ใช้ในการทดลอง และควรมีการทดสอบซ้ำ 3 หรือ 5 ครั้งเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่น่าเชื่อถือ

ขั้นตอนการทำ Agar well diffusion สำหรับทดสอบฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรีย

1. เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยเทอาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็งที่ยังหลอมอยู่ อุณหภูมิประมาณ 50 oC (เช่น Mueller-Hinton agar; MBA หรือ Nutrient agar; NA) ลงในจานเพาะเชื้อ แล้วรอให้อาหารแข็งตัว

2. เตรียมเชื้อแบคทีเรีย ทำการเพาะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียที่ต้องการทดสอบในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเหลว (เช่น Nutrient broth; NB หรือ Luria Bertani broth; LB) จากนั้นนำเชื้อแบคทีเรียทดสอบมาปรับความขุ่นให้เท่ากับสารแขวนลอยมาตรฐาน Mcfarland No. 0.5 (จะมีเชื้อประมาณ 1.5 x 108 CFU/ml) ด้วย 0.85 % โซเดียมคลอไรด์ แล้วเกลี่ยเชื้อให้ทั่วผิวหน้าจานเพาะเชื้อ (อาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็ง) ด้วยไม้พันสำลีที่ปราศจากเชื้อ (Cotton swab)

3. เจาะหลุมโดยใช้ Cork borer หรืออุปกรณ์เจาะหลุมอื่น ๆ เจาะหลุมบนอาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็งให้มีขนาดและระยะห่างที่เหมาะสม (เช่น เส้นผ่านศูนย์กลาง 6 mm ห่างกันประมาณ 2-3 cm)

4. เติมสารที่ต้องการทดสอบ (เช่น สารสกัดจากพืช สัตว์ จุลินทรีย์ สารเคมี หรือยาปฏิชีวนะ) ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ ในหน่วย 𝜇g/ml หรือ mg/ml ลงในหลุมที่เจาะไว้ โดยใช้ปริมาตร 20-50 ไมโครลิตร

5. เตรียมชุดควบคุมบวกและลบ โดยชุดควบคุมบวกมักเป็นยาปฏิชีวนะที่เชื้อทดสอบนั้น ๆ มีความไว เช่น ยาปฏิชีวนะเจนตามัยซิน (Gentamicin) ความเข้มข้น 10 ไมโครกรัม (ให้ผลบวกเสมอ คือ ต้องมี Inhibition zone) และชุดควบคุมลบซึ่งมักเป็นตัวทำละลายที่ใช้เตรียมสารสกัด เช่น ใช้สารละลาย DMSO หรือน้ำกลั่น (ให้ผลลบเสมอ คือ ต้องไม่มี Inhibition zone)

6. ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาอย่างน้อย 1 ชั่วโมง แล้วนำจานเพาะเชื้อไปบ่มในตู้บ่มเชื้อที่อุณหภูมิและเวลาที่เหมาะสมกับเชื้อแบคทีเรียที่ใช้ทดสอบ (เช่น 37°C เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง)

7. อ่านผล โดยสังเกตและวัดขนาดของบริเวณใสหรือบริเวรยับยั้งที่ไม่มีการเจริญของเชื้อ (Inhibition zone) รอบ ๆ หลุม ด้วยเวอร์เนียร์คาร์ลิเปอร์ (Vernier caliper) หรือไม้บรรทัด ในหน่วยมิลลิเมตร (mm) บันทึกผลและวิเคราะห์ผลการทดลอง ขนาดของ Inhibition zone เป็นตัวบ่งชี้ถึงความสามารถในการยับยั้งแบคทีเรียของสารนั้น

หมายเหตุ สารสกัดที่ใช้ทดสอบต้องปลอดเชื้อก่อนเสมอ หากเตรียมสารสกัดโดยใช้ตัวทำละลายที่ไม่มีฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์ต่าง ๆ ได้จะเป็นการดี โดยต้องเตรียมสารสกัดให้มีความเข้มข้นสูง ๆ แล้วทำการเจือจางลงด้วยน้ำกลั่นปลอดเชื้อก่อนนำไปใช้งาน

การเตรียมสารสกัด (จากพืช สัตว์ หรือจุลินทรีย์)

1. นำตัวอย่างที่แห้งแล้ว (หรืออยู่ในสภาพที่พร้อมสกัด) ใส่ในโหลแก้วหรือภาชนะที่เหมาะสมปิดฝาได้สนิท

2. เติมตัวทำละลายที่เหมาะสม เช้น เหล้าขาว (40% v/v Ethanol; EtOH) ลงในโหลแก้วให้ท่วมตัวอย่างพอดี แล้วปิดฝาให้สนิท ใช้ถุงร้อนเพิ่มความสนิทได้ แช่ไว้ประมาณ 48 ชั่วโมง

3. เมื่อครบเวลาทำการกรองสารสกัดโดยใช้สำลีและการดาษกรอง (Whatman No. 1) ให้สำลีอยู่ด้านบน กรองใส่ในภาชนะมีฝาปิด ทำการวัดปริมาตร (ml) และบันทึกลักษณะสารสกัดที่ได้

การหาน้ำหนักของสารสกัดแบบเหลว

1. เตรียมภาชนะแก้วที่ใส่สารได้ประมาณ 10 ml จำนวน 3 ใบ ทำความสะอาดและทำให้แห้งสนิท แล้วชั่งน้ำหนักภาชนะด้วยเครื่องชั่งอย่างน้อย 2 ตำแหน่ง

2. เติมสารสกัดปริมาตรแน่นอนที่ 5 หรือ 10 ml ทำให้แห้งสนิทติดภาชนะแก้วด้วยการต้มให้ความร้อน (อย่าให้ไหม้) ***สิ่งที่ได้ไม่ได้นำไปใช้งานต่อ เพราะสารออกฤทธิ์เสียสภาพแล้ว แต่ใช้เพื่อหาน้ำหนักสารเท่านั้น

3. หลังแห้งสนิทแล้ว นำภาชนะและสารแห้งที่ได้ไปชั่งน้ำหนักด้วยเครื่องชั่งอย่างน้อย 2 ตำแหน่ง อีกครั้ง

4. ทำการคำนวณหาน้ำหนักสารในปริมาตรแน่นอนที่ 5 หรือ 10 ml โดยใช้น้ำหนักภาชนะและสารแห้งที่ได้ลบด้วยน้ำหนักภาชนะเริ่มต้น (a g/5 ml หรือ b g/10 ml) และคำนวณให้ทราบความเข้มข้น c g/ml

5. ทำการคำนวณหาน้ำหนักสารในสารสกัด (ของเหลว) ทั้งหมด เพื่อใช้คำนวณหาร้อยละของผลผลิต

ร้อยละของผลผลิต = (น้ำหนักสารในสารสกัด (ของเหลว) ทั้งหมด / น้ำหนักตัวอย่างแห้งทั้งหมด) x 100

ทีมผู้จัดในฐาน ::
อาจารย์ ดร.วิญญู ภักดี สาขาวิชาจุลชีววิทยา
นางสาวกาญจนา ราชสุวรรณ (นักวิทยาศาสตร์)

นายสุริยัน พุทธอุทัย (จุลชีววิทยา ปี 3)

นางสาวสุวรา หิรัญรักษ์ (จุลชีววิทยา ปี 3)
นายนภัส พูลสวัสดิ์ (ชีววิทยา ปี 4)

นางสาวสุกัญญา สำเร็จ (ชีววิทยา ปี 3)

นางสาวอรพรรณ กลิ่นราย (ชีววิทยา ปี 3)

คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี
มหาวิทยาลัยราชภัฏรำไพพรรณี