การทดสอบด้วยวิธี Agar well diffusion

การทดสอบด้วยวิธี Agar well diffusion เป็นวิธีการประเมินฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์ต่าง ๆ เช่น เชื้อแบคทีเรีย เชื้อยีสต์ หรือเชื้อรา ของสารต่าง ๆ โดยการเจาะหลุมบนอาหารเลี้ยงเชื้อ (Agar) ที่มีจุลินทรีย์ แล้วเติมสารที่ต้องการทดสอบลงไปในหลุม สารนั้นจะแพร่ออกไปในอาหารเลี้ยงเชื้อ ทำให้เกิดบริเวณที่จุลินทรีย์ไม่เจริญรอบ ๆ หลุม (Inhibition zone) ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ถึงฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์นั้น ๆ ของสารนั้น ๆ ข้อดีของวิธี Agar well diffusion คือ เป็นวิธีที่ง่าย สะดวก และประหยัด ไม่ต้องใช้ Paper disc ที่มีราคาแพง สามารถทดสอบฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์ของสารหลาย ๆ ชนิดได้ในการทดลองเดียวกัน สามารถใช้ประเมินฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์เบื้องต้นได้ ข้อจำกัด คือ ไม่สามารถบอกค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่ยับยั้งเชื้อได้ (Minimum inhibitory concentration; MIC) และค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่ฆ่าเชื้อได้ (Minimum microcidal concentration; MMC หรือ Minimum bactericidal concentration; MBC ใช้สำหรับการทดสอบกับแบคทีเรีย) วิธี Agar well diffusion อาจมีผลกระทบจากปัจจัยอื่น ๆ เช่น การแพร่กระจายของสารในอาหารเลี้ยงเชื้อ วิธี Agar well diffusion สามารถประยุกต์ใช้ในการคัดกรองฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ของสารสกัดจากพืช สมุนไพร จุลินทรีย์ สารสังเคราะห์ต่าง ๆ หรือศึกษาฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรียของยาปฏิชีวนะและยาต้านจุลินทรีย์อื่น ๆ การตรวจสอบคุณภาพของยาปฏิชีวนะและผลิตภัณฑ์อื่น ๆ ที่มีฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ แต่ควรเลือกอาหารเลี้ยงเชื้อและสภาวะการบ่มที่เหมาะสมกับชนิดของเชื้อจุลินทรีย์ที่ใช้ทดสอบ ควรมีการควบคุมคุณภาพของจุลินทรีย์ที่ใช้ทดสอบและสารที่ใช้ในการทดลอง และควรมีการทดสอบซ้ำ 3 หรือ 5 ครั้งเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่น่าเชื่อถือ

ขั้นตอนการทำ Agar well diffusion สำหรับทดสอบฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรีย

1. เตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยเทอาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็งที่ยังหลอมอยู่ อุณหภูมิประมาณ 50 oC (เช่น Mueller-Hinton agar; MBA หรือ Nutrient agar; NA) ลงในจานเพาะเชื้อ แล้วรอให้อาหารแข็งตัว

2. เตรียมเชื้อแบคทีเรีย ทำการเพาะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียที่ต้องการทดสอบในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเหลว (เช่น Nutrient broth; NB หรือ Luria Bertani broth; LB) จากนั้นนำเชื้อแบคทีเรียทดสอบมาปรับความขุ่นให้เท่ากับสารแขวนลอยมาตรฐาน Mcfarland No. 0.5 (จะมีเชื้อประมาณ 1.5 x 108 CFU/ml) ด้วย 0.85 % โซเดียมคลอไรด์ แล้วเกลี่ยเชื้อให้ทั่วผิวหน้าจานเพาะเชื้อ (อาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็ง) ด้วยไม้พันสำลีที่ปราศจากเชื้อ (Cotton swab)

3. เจาะหลุมโดยใช้ Cork borer หรืออุปกรณ์เจาะหลุมอื่น ๆ เจาะหลุมบนอาหารเลี้ยงเชื้อแบบแข็งให้มีขนาดและระยะห่างที่เหมาะสม (เช่น เส้นผ่านศูนย์กลาง 6 mm ห่างกันประมาณ 2-3 cm)

4. เติมสารที่ต้องการทดสอบ (เช่น สารสกัดจากพืช สัตว์ จุลินทรีย์ สารเคมี หรือยาปฏิชีวนะ) ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ ในหน่วย 𝜇g/ml หรือ mg/ml ลงในหลุมที่เจาะไว้ โดยใช้ปริมาตร 50-100 ไมโครลิตร

5. เตรียมชุดควบคุมบวกและลบ โดยชุดควบคุมบวกมักเป็นยาปฏิชีวนะที่เชื้อทดสอบนั้น ๆ มีความไว เช่น ยาปฏิชีวนะเจนตามัยซิน (Gentamicin) ความเข้มข้น 10 ไมโครกรัม (ให้ผลบวกเสมอ คือ ต้องมี Inhibition zone) และชุดควบคุมลบซึ่งมักเป็นตัวทำละลายที่ใช้เตรียมสารสกัด เช่น ใช้สารละลาย DMSO หรือน้ำกลั่น (ให้ผลลบเสมอ คือ ต้องไม่มี Inhibition zone)

6. ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาอย่างน้อย 1 ชั่วโมง แล้วนำจานเพาะเชื้อไปบ่มในตู้บ่มเชื้อที่อุณหภูมิและเวลาที่เหมาะสมกับเชื้อแบคทีเรียที่ใช้ทดสอบ (เช่น 37°C เป็นเวลา 18-24 ชั่วโมง)

7. อ่านผล โดยสังเกตและวัดขนาดของบริเวณใสหรือบริเวรยับยั้งที่ไม่มีการเจริญของเชื้อ (Inhibition zone) รอบ ๆ หลุม ด้วยเวอร์เนียร์คาร์ลิเปอร์ (Vernier caliper) หรือไม้บรรทัด ในหน่วยมิลลิเมตร (mm) บันทึกผลและวิเคราะห์ผลการทดลอง ขนาดของ Inhibition zone เป็นตัวบ่งชี้ถึงความสามารถในการยับยั้งแบคทีเรียของสารนั้น

หมายเหตุ สารสกัดที่ใช้ทดสอบต้องปลอดเชื้อก่อนเสมอ หากเตรียมสารสกัดโดยใช้ตัวทำละลายที่ไม่มีฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์ต่าง ๆ ได้จะเป็นการดี โดยต้องเตรียมสารสกัดให้มีความเข้มข้นสูง ๆ แล้วทำการเจือจางลงด้วยน้ำกลั่นปลอดเชื้อก่อนนำไปใช้งาน

การเตรียมสารสกัด (จากพืช สัตว์ หรือจุลินทรีย์)

1. นำตัวอย่างที่แห้งแล้ว (หรืออยู่ในสภาพที่พร้อมสกัด) ใส่ในโหลแก้วหรือภาชนะที่เหมาะสมปิดฝาได้สนิท

2. เติมตัวทำละลายที่เหมาะสม เช้น เหล้าขาว (40% v/v Ethanol; EtOH) ลงในโหลแก้วให้ท่วมตัวอย่างพอดี แล้วปิดฝาให้สนิท ใช้ถุงร้อนเพิ่มความสนิทได้ แช่ไว้ประมาณ 48 ชั่วโมง

3. เมื่อครบเวลาทำการกรองสารสกัดโดยใช้สำลีและการดาษกรอง (Whatman No. 1) ให้สำลีอยู่ด้านบน กรองใส่ในภาชนะมีฝาปิด ทำการวัดปริมาตร (ml) และบันทึกลักษณะสารสกัดที่ได้

การหาน้ำหนักของสารสกัดแบบเหลว

1. เตรียมภาชนะแก้วที่ใส่สารได้ประมาณ 10 ml จำนวน 3 ใบ ทำความสะอาดและทำให้แห้งสนิท แล้วชั่งน้ำหนักภาชนะด้วยเครื่องชั่งอย่างน้อย 2 ตำแหน่ง

2. เติมสารสกัดปริมาตรแน่นอนที่ 5 หรือ 10 ml ทำให้แห้งสนิทติดภาชนะแก้วด้วยการต้มให้ความร้อน (อย่าให้ไหม้) ***สิ่งที่ได้ไม่ได้นำไปใช้งานต่อ เพราะสารออกฤทธิ์เสียสภาพแล้ว แต่ใช้เพื่อหาน้ำหนักสารเท่านั้น

3. หลังแห้งสนิทแล้ว นำภาชนะและสารแห้งที่ได้ไปชั่งน้ำหนักด้วยเครื่องชั่งอย่างน้อย 2 ตำแหน่ง อีกครั้ง

4. ทำการคำนวณหาน้ำหนักสารในปริมาตรแน่นอนที่ 5 หรือ 10 ml โดยใช้น้ำหนักภาชนะและสารแห้งที่ได้ลบด้วยน้ำหนักภาชนะเริ่มต้น (a g/5 ml หรือ b g/10 ml) และคำนวณให้ทราบความเข้มข้น c g/ml

5. ทำการคำนวณหาน้ำหนักสารในสารสกัด (ของเหลว) ทั้งหมด เพื่อใช้คำนวณหาร้อยละของผลผลิต

ร้อยละของผลผลิต = (น้ำหนักสารในสารสกัด (ของเหลว) ทั้งหมด / น้ำหนักตัวอย่างแห้งทั้งหมด) x 100

ทีมผู้จัดในฐาน :: อ.ดร.วิญญู ภักดี สาขาวิชาจุลชีววิทยา

นายสุริยัน พุทธอุทัย (จุลชีววิทยา ปี 3)

นางสาวสุวรา หิรัญรักษ์ (จุลชีววิทยา ปี 3)

นางสาวปณิตา คล้ายสุบรรณ (ชีววิทยา ปี 3)

นางสาวสุกัญญา สำเร็จ (ชีววิทยา ปี 3)

นางสาวอรพรรณ กลิ่นราย (ชีววิทยา ปี 3)

คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี
มหาวิทยาลัยราชภัฏรำไพพรรณี